Detekce mutací v gyrB pomocí denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Technologie DHPLC professional vysoce výkonnou detekci mutací v populaci TILLING z tvrdé pšenice

POZADÍ

Pšenice tvrdá (Triticum turgidum L.) je obilná plodina široce pěstovaná ve středomořských oblastech; jantarové zrno se používá hlavně ok výrobě těstovin, kuskusu a typického chleba. Detekční technologie s jedním nukleotidovým polymorfismem (SNP) a indukce mutací s vysokou propustností představují novou výzvu v chovu pšenice ok identifikaci alelické variace u velkých populací.

Strategie TILLING využívá tradiční chemickou mutagenezi s následným screeningem na neshody jedné báze ok identifikaci nových mutantních lokusů. Přestože TILLING byl kombinován s několika citlivými předběžnými screeningovými metodami professional analýzu SNP, většina se spoléhá na drahé vybavení. Nedávno byl v diagnostice molekulárních lidí použit ok detekci neznámých mutací nový protokol DHPLC s nízkými náklady a časem .

VÝSLEDEK

V této práci jsme vyvinuli novou populaci OBILOVÁNÍ tvrdé pšenice (cv. Marco Aurelio) s použitím 0,70-0,85% ethylmethansulfonátu (EMS). Aby se prozkoumala účinnost mutagenního ošetření, byl proveden pilotní screening na 1140 mutantních liniích zaměřených na dva cílové geny (lykopen epsilon-cykláza, ε-LCY a lykopen beta-cykláza , β-LCY) podílející se na metabolismu karotenoidů v pšenici zrna.

Zjednodušujeme detekci heteroduplexu dvěma nízkonákladovými metodami: technikou enzymatického štěpení (CelI) / agarosový gel a denaturační vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (DHPLC) . Přístup na gelu CelI / agaróza nám umožnil identifikovat 31 mutací, zatímco postup DHPLC detekoval u obou genů celkem 46 mutací.

Všechny detekované mutace byly potvrzeny přímým sekvenováním. Odhadovaná celková frekvence mutací professional pilotní check metodikou DHPLC byla 1/77 kb, což představuje vysokou pravděpodobnost detekce zajímavých mutací v cílových genech.

ZÁVĚRY

Ukázali jsme použitelnost a účinnost nové strategie professional detekci indukované variability. Vytvořili jsme a charakterizovali novou populaci OBILOVÁNÍ tvrdé pšenice, která je užitečná professional lepší pochopení klíčových genových funkcí. Dostupnost tohoto nástroje spolu s technikou TILLING rozšíří polymorfismy v kandidátských genech agronomicky významných znaků v pšenici.

Nastavení protokolu molekulární diagnostiky mutací β-talasémie v Tunisku pomocí denaturující vysoce výkonné kapalinové chromatografie ( DHPLC ).

POZADÍ

β-talasémie je jednou z celosvětově nejrozšířenějších autozomálně recesivních poruch . Představuje velkou molekulární heterogenitu vyplývající z více než 200 kauzálních mutací v genu β-globinu. V Tunisku představuje β- talasémie nejběžnější monogenní poruchu hemoglobinu s 2,21% nosičů.

Účinné a spolehlivé metody screeningu mutací jsou nezbytné professional zavedení vhodných preventivních programů professional rizikové páry. Cílem této studie je vyvinout efektivní metodu založenou na denaturační vysoce výkonné kapalinové chromatografii (DHPLC), při které je celý gen β-globinu (HBB) vyšetřován na mutace pokrývající přibližně 90% spektra.

METODY

Provedli jsme validaci testu DHPLC professional přímou genotypizaci 11 známých mutací β-thalassemie v tuniské populaci.

VÝSLEDEK

Stanovení DHPLC bylo stanoveno na základě analýzy 62 archivních vzorků β-thalasemie dříve genotypovaných, poté validovaných s plnou shodou na 50 testech se slepými randomizovanými vzorky dříve genotypovanými sekvenováním DNA a s 96% konzistencí na 40 vzorcích jako prospektivní studie.

ZÁVĚRY

Ve srovnání s jinými technikami genotypizace může metoda DHPLC splňovat požadavky přímé genotypizace známých mutací β-talasémie v Tunisku a může být použita jako účinný nástroj professional genetický screening prenatálních a postnatálních jedinců.

Detekce mutací v gyrB pomocí denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografie ( DHPLC ) mezi sérovarem Salmonella enterica Serov Typhi a Paratyphi A.

Rezistence na fluorchinolony je zprostředkována mutacemi v oblasti určující rezistenci na chinolon (QRDR) genů topoizomerázy. Denaturační vysoce účinná kapalinová chromatografie (DHPLC) byla hodnocena na detekci klinicky důležitých mutací v gyrB u Salmonella.

Salmonella Typhi a S. Paratyphi A charakterizované professional mutaci v QRDR gyrA, parC a parE byly studovány na mutaci v gyrB pomocí DHPLC a validovány sekvenováním.

Analýza DHPLC dokázala vyřešit testovanou mutantu z izolátů s gyrB divokého typu a odlišit mutanty od ostatních mutantů podle profilu píku a posunu v retenčním čase. Tři varianty sekvencí byly detekovány na kodonu 464 a byla také detekována nová mutace Ser → Thr . Mutace gyrB byla spojena s neklasickou rezistencí na chinolon (NALS-CIPDS) pouze u 34 izolátů S. Typhi a byla odlišná od klasické rezistence na chinolon spojená s mutacemi gyrA (NALR-CIPDS).

Rozmanitost mikrobioty podílející se na výrobě vína a organického jablečného moštu ponořila do výroby octa, jak odhalila analýza DHPLC a sekvenování nové generace.

Nefiltrované vzorky octa odebrané ze tří oxidačních cyklů ponořené průmyslové výroby každého z nich, červeného vína a organických jablečných octů, byly odebrány ve slovinské společnosti vyrábějící ocet . Vzorky byly systematicky odebírány od začátku do konce oxidačního cyklu a použity professional kultivační nezávislé mikrobiální analýzy prováděné denaturací vysokotlakou kapalinovou chromatografií (DHPLC) a sekvenováním Illumina MiSeq 16 variabilních oblastí genu rRNA .

Oba přístupy prokázaly velmi homogenní bakteriální strukturu během výroby vinného octa, ale heterogennější během výroby organického jablečného octa. Ve všech vzorcích vinného octa byl převládajícím druhem Komagataeibacter oboediens (dříve Gluconacetobacter oboediens) . V jablečném octě byly bakterie kyselina octová a kyselina mléčná dvě hlavní skupiny bakterií.

Bakteriální konsorcium professional kyselinu octovou se skládalo z Acetobacter a Komagataeibacter s rodem Komagataeibacter, který na konci oxidačního cyklu konkuroval Acetobacter ve všech vzorcích jablečného octa.

Mezi bakteriálním konsorciem s kyselinou mléčnou byly identifikovány dva dominující rody, Lactobacillus a Oenococcus, přičemž Oenococcus převažuje se zvyšující se koncentrací kyseliny octové v octech.

Menším rodem bakteriálního konsorcia kyseliny octové v organickém jablečném octě byl neočekávaně Gluconobacter , což naznačuje možný vývoj populace Gluconobacter s tolerancí vůči ethanolu a kyselině octové. Mezi doprovodné bakterie vinného octa, roduByl zjištěn rhodokok , ale na konci oxidačních cyklů se podstatně snížil.

Metody v

molekulární kardiologii:   Analýza detekce mutací DHPLC .

V genech podílejících se na srdečních poruchách byl identifikován rostoucí počet mutací, což vedlo ok novým poznatkům v patofyziologii dědičných srdečních onemocnění. V důsledku těchto zjištění jsou implementovány techniky specializované na automatizovanou analýzu s vysokou propustností, aby zvládly rostoucí počet diagnostických genetických požadavků.

Jednou z takových nových technik, která splňuje kritéria rychlosti, citlivosti a přesnosti, je denaturační vysoce účinná kapalinová chromatografie (DHPLC) . Toto číslo se zaměřuje na základní princip techniky a ilustruje, jak lze identifikovat genetické změny.